細(xì)胞培養(yǎng)物解離是細(xì)胞培養(yǎng)物維持的關(guān)鍵步驟。它涉及將細(xì)胞從其生長表面分離以進行傳代培養(yǎng)或收獲。本節(jié)概述了兩種主要方法：使用無酶解離緩沖液和使用酶試劑。

1. 使用無酶細(xì)胞解離緩沖液

該方法非常溫和，無需使用酶即可保持細(xì)胞完整性：

1. 準(zhǔn)備

• 確保所有試劑在使用前加熱至 37°C，以避免對細(xì)胞造成沖擊。

2. 去除生長培養(yǎng)基：

• 從培養(yǎng)容器中丟棄舊的生長培養(yǎng)基。

3. 漂洗

• 每個 T75 燒瓶或 100 mm 培養(yǎng)皿用 5 ml 不含鈣和鎂的 PBS 沖洗細(xì)胞單層。

• 在室溫下輕輕搖動容器 30 至 60 秒。

• 吸出并丟棄沖洗溶液。

• 再次重復(fù)此沖洗步驟。

4. 解離

• 將大約 5 ml 無酶細(xì)胞解離緩沖液添加到容器中。

• 在室溫下輕輕搖動 1 至 2 分鐘，然后在顯微鏡下檢查解離情況。

• 如有必要，用手輕敲燒瓶或培養(yǎng)皿以去除細(xì)胞。

• 如果細(xì)胞貼壁，讓它們在室溫下再靜置 2 至 5 分鐘，并根據(jù)需要再次敲擊，使用更多的解離緩沖液。

• 細(xì)胞分離后，添加至少 5 ml 全生長培養(yǎng)基以中和解離緩沖液并重懸細(xì)胞。

5. 活力檢查

• 在傳代培養(yǎng)過程中監(jiān)測細(xì)胞活力，確保其保持在 90% 以上。

2. 使用其他試劑進行解離

該方法允許使用各種解離試劑：

1. 去除用過的介質(zhì)

• 丟棄培養(yǎng)容器中的舊介質(zhì)。

2. 洗滌細(xì)胞

• 用不含鈣和鎂的平衡鹽溶液清洗細(xì)胞，或使用 EDTA。

• 將洗滌液輕輕添加到細(xì)胞對面，并搖動容器 1 至 2 分鐘，然后丟棄洗滌液。

3. 解離

• 每 25 平方厘米的生長表面涂抹 2 至 3 毫升所選的解離溶液，確保覆蓋細(xì)胞片層。

• 將容器在 37°C 下孵育并輕輕搖動。解離通常發(fā)生在 5 至 15 分鐘內(nèi)，具體取決于細(xì)胞系。

• 對于頑固的細(xì)胞，敲擊容器可以加快這一過程。

• 仔細(xì)觀察細(xì)胞以防止過度暴露和潛在的損壞。

4. 收獲細(xì)胞

• 一旦細(xì)胞分離，將其直立，讓它們收集在容器底部。

• 添加完整的培養(yǎng)基，然后通過移液到細(xì)胞層上分散并收集細(xì)胞。

• 計數(shù)并繼續(xù)傳代。

在這兩種方法中，重要的是通過經(jīng)驗觀察確定每個細(xì)胞系的最佳條件。該過程應(yīng)保留細(xì)胞活力，在傳代培養(yǎng)過程中應(yīng)定期檢查細(xì)胞活力是否超過 90%。這些程序為研究人員根據(jù)其細(xì)胞系的具體要求和特征進行調(diào)整奠定了基礎(chǔ)。