外切β1，4葡聚糖酶/纖維二糖水解酶（C1）測試盒

微量法 100管/48樣

正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

C1（EC3.2.1.91）存在于細(xì)菌、真菌和動物體內(nèi)，是纖維素酶系的組份之一，C1催化多聚糖鏈的末端非還原端釋放出纖維二糖和葡萄糖。

測定原理：

采用3,5－二硝基水楊酸法測定C1催化微晶纖維素降解產(chǎn)生的還原糖的含量。

需自備的儀器和用品：

酶標(biāo)儀/可見分光光度計、水浴鍋、離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板/微量石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體6mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：液體25mL×1瓶，4℃保存；

樣品測定的準(zhǔn)備： 

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1. 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至540nm，蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表（在EP管中依次加入下列試劑）：

混勻，37℃準(zhǔn)確水浴2h

混勻， 90℃水浴10min（蓋緊，防止水分散失），冷卻后，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中，測540nm下吸光值A(chǔ)，計算ΔA=A測定管-A對照管。每個測定管需設(shè)一個對照管。

C1活性計算

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為y = 6.4078x - 0.0673；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y為吸光值。

2、血清（漿）C1活力的計算

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

C1活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反總]÷V樣÷T

=14.305×(ΔA+0.0673)

3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中C1活力的計算

（1）按照蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

C1活力(μg /min/mg prot)=[ [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反總]÷(V樣×Cpr) ÷T

=14.305×(ΔA+0.0673) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

C1活力(μg /min /g鮮重)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反總]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T

=14.305×(ΔA+0.0673) ÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

C1活力(μg /min /104 cell)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反總]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T

=0.0286×(ΔA+0.0673)

1000：1mg/mL=1000ug/mL；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.11mL； V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，120 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為y = 3.2039x - 0.0673；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y為吸光值。

2、血清（漿）C1活力的計算

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

C1活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V反總]÷V樣÷T

=28.61×(ΔA+0.0673)

3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中C1活力的計算

（1）按照蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

C1活力(μg /min/mg prot)=[ [1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V反總]÷(V樣×Cpr) ÷T

=28.61×(ΔA+0.0673) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

C1活力(μg /min /g鮮重)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V反總]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T

=28.61×(ΔA+0.0673) ÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

C1活力(μg /min /104 cell)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V反總]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T

=0.057×(ΔA+0.0673)

1000：1mg/mL=1000ug/mL；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.11mL； V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，120 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。

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